التعريف: تقنيات تتجلى في عزل مورثة ذات منفعة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة بهدف تغيير هذه الخلية وراثيا.
I - كيف يمكن ادن عزل مورثة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة ؟ وما هي أدوات الهندسة الوراثية ؟
1- عزل المورثة المرغوب فيها (ذات منفعة خاصة )
1-1- تجزيء ADN:
تذكر أن المورثة جزء من ADN وأن هذا الأخير متمو ضع داخل نواة الخلية.لبلوغ هذه المورثة لابد من هرس الخلايا والتخلص من الغشائين .
الخطوة المالية تتجلى في تجزيء ADN بهدف عزل المورثة المرغوب فيها: نستعمل لهذا الغرض نوع من الأنزيمات تعرف بأنزيمات الفصل. مثال أنزيم الفصل ECORI
بعض النماذج الأخرى من أنزيمات الفصل :المتتالية المرغوب فيها ليست مجهولة وبالتالي فأنزيم الفصل المناسب يتحدد حسب مواقع القطع المؤدية للمورثة
تذكر أننا نتوفر على معلومات كافية حول الجزء المبحوث عنه ضمن الأجزاء الناتجة عن تجزيء ADN.
في البداية لابد من فصل الأجزاء فيما بينها: نستعمل تقنية الهجرة الكهربائية Elèctrophorése .
بعد ذالك يتم فصل مختلف أشرطة الأجزاء فيما بينها ونسلط عليها ARN مجس (له القدرة الارتباط بجزء ADN المبحوث عنه)
1-2: النسخ العكسي: يمكن الحصول على المورثة المرغوب فيها كذلك من خلال ARNm باستعمال أنزيم خاص يعرف بأنزيم النسخ العكسي
نحصل على ADN أحادي اللولب بوجود النيكليوتيدات الأربع المكونة ل ADN وبوجود أنزيم البلمرة ADN polymérase نحصل على اللولب الثاني.
2- تلميم المورثة المعزولة : لتفادي ضياع المورثة نقوم باستنساخها ( التلميم ) نستعمل لهذا الغرض تقنية PCR .
3- دمج المورثة في الخلية العائلة:
هذه العملية تحتاج إلى وسيلة ناقلة : في الهندسة الوراثية نستعمل عادة البلاسميد Plasmide : عبارة عن جزيئة ADNحلقية توجد في سيتوبلازم البكتيرية
يتم فتح البلاسميد بواسطة أنزيم الفصل وبواسطة أنزيم الربط يتم دمج البلاسميد ( يشترط وجود أطراف موحدة بين كل من المورثة والبلاسميد)
يصبح البلاسميد مركب بعد دمجه للمورثة الدخيلة. يتم بعد ذلك إعادة البلاسميد المركب إلى البكتيرية العائلة بوجود ايونات الكالسيوم. بجوار المورثة البنيوية يتم دمج مورثة منظمة لعملها لكي يتم تعبير المورثة البنيوية.
4- زرع الخلايا العائلة في مخمرات صناعية:
تهدف هذه العملية إلى جعل الخلية المركبة تتكاثر بهدف إنتاج أكبر كمية من المادة الناتجة عن ترجمة المورثة المدمجة في البلاسميد .نوفر للخلايا المزروعة وسط زراعي أمثل .قبل زرع الخلايا لابد من التأكد من كونها تحتوي فعلا على البلاسميد المركب,نستغل لهذا الغرض خصائص البلاسميد قبل وبعد معالجته.
لاحظ أن البلاسميد المستعمل هنا يتميز بوجود مورثتين : Amp R (مقومة الأمبيسلين) و Tet R (مقاومة التتراسكلين) بعد دمجه للمورثة الجديدة فقد المورثة الأولى دون الثانية .ادن البكتيرية الحساسة لأمبيسلين والمقاومة لتتراسكلين هي من تتميز بتوفرها على البلاسميد المركب.
-II تطبيقات الهندسة الوراثية (في طور الانجاز)
1- في المجال الصيدلي: إنتاج الأنسولين.......
I - كيف يمكن ادن عزل مورثة من خلية ونقلها إلى خلية عائلة ؟ وما هي أدوات الهندسة الوراثية ؟
1- عزل المورثة المرغوب فيها (ذات منفعة خاصة )
1-1- تجزيء ADN:
تذكر أن المورثة جزء من ADN وأن هذا الأخير متمو ضع داخل نواة الخلية.لبلوغ هذه المورثة لابد من هرس الخلايا والتخلص من الغشائين .
الخطوة المالية تتجلى في تجزيء ADN بهدف عزل المورثة المرغوب فيها: نستعمل لهذا الغرض نوع من الأنزيمات تعرف بأنزيمات الفصل. مثال أنزيم الفصل ECORI
بعض النماذج الأخرى من أنزيمات الفصل :المتتالية المرغوب فيها ليست مجهولة وبالتالي فأنزيم الفصل المناسب يتحدد حسب مواقع القطع المؤدية للمورثة
تذكر أننا نتوفر على معلومات كافية حول الجزء المبحوث عنه ضمن الأجزاء الناتجة عن تجزيء ADN.
في البداية لابد من فصل الأجزاء فيما بينها: نستعمل تقنية الهجرة الكهربائية Elèctrophorése .
بعد ذالك يتم فصل مختلف أشرطة الأجزاء فيما بينها ونسلط عليها ARN مجس (له القدرة الارتباط بجزء ADN المبحوث عنه)
1-2: النسخ العكسي: يمكن الحصول على المورثة المرغوب فيها كذلك من خلال ARNm باستعمال أنزيم خاص يعرف بأنزيم النسخ العكسي
نحصل على ADN أحادي اللولب بوجود النيكليوتيدات الأربع المكونة ل ADN وبوجود أنزيم البلمرة ADN polymérase نحصل على اللولب الثاني.
| مثال: لنعتبر جزء من ARNm |  |
| بفضل أنزيم النسخ العكسي نحصل على ADN أحادي اللولب التالي |  |
| وبفضل أنزيم البلمرة ADN polymérase |  |
| المبدأ: تدبدب الحرارة خلال دورة محددة بين 40 و90 درجة: | في حرارة 90 درجة ينفصل شريطي المورثة فيما بينهما (تلاشي الروابط الهيدروجينية) |
| في حرارة 40 درجة يقوم ADN polymérase ببلمرة شريطين جديدين وفق الآلية النصف | |
| محا فضة (أنظر الآلية..........) نفس الدورة تتكرر عدة مرات نحصل على نسخ عديدة للمورثة. |
3- دمج المورثة في الخلية العائلة:
هذه العملية تحتاج إلى وسيلة ناقلة : في الهندسة الوراثية نستعمل عادة البلاسميد Plasmide : عبارة عن جزيئة ADNحلقية توجد في سيتوبلازم البكتيرية
يتم فتح البلاسميد بواسطة أنزيم الفصل وبواسطة أنزيم الربط يتم دمج البلاسميد ( يشترط وجود أطراف موحدة بين كل من المورثة والبلاسميد)
يصبح البلاسميد مركب بعد دمجه للمورثة الدخيلة. يتم بعد ذلك إعادة البلاسميد المركب إلى البكتيرية العائلة بوجود ايونات الكالسيوم. بجوار المورثة البنيوية يتم دمج مورثة منظمة لعملها لكي يتم تعبير المورثة البنيوية.
4- زرع الخلايا العائلة في مخمرات صناعية:
تهدف هذه العملية إلى جعل الخلية المركبة تتكاثر بهدف إنتاج أكبر كمية من المادة الناتجة عن ترجمة المورثة المدمجة في البلاسميد .نوفر للخلايا المزروعة وسط زراعي أمثل .قبل زرع الخلايا لابد من التأكد من كونها تحتوي فعلا على البلاسميد المركب,نستغل لهذا الغرض خصائص البلاسميد قبل وبعد معالجته.
لاحظ أن البلاسميد المستعمل هنا يتميز بوجود مورثتين : Amp R (مقومة الأمبيسلين) و Tet R (مقاومة التتراسكلين) بعد دمجه للمورثة الجديدة فقد المورثة الأولى دون الثانية .ادن البكتيرية الحساسة لأمبيسلين والمقاومة لتتراسكلين هي من تتميز بتوفرها على البلاسميد المركب.
-II تطبيقات الهندسة الوراثية (في طور الانجاز)
1- في المجال الصيدلي: إنتاج الأنسولين.......
